在生命科学与医学研究领域，精确检测生物分子的含量和活性是探索生命奥秘、攻克疾病难题的关键环节。博清生物科技（南京）有限公司研发生产的酶标仪作为一种能够快速、高效测定微孔板中吸光度或荧光强度的仪器，在众多科研实验中发挥着不可或缺的作用。本实验以检测血清中某肿瘤标志物含量为例，详细介绍酶标仪在科研实验中的具体应用过程。

一、实验目的

利用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术结合酶标仪，准确测定不同患者血清样本中肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）的含量，通过分析其含量差异，为肿瘤的早期诊断、病情监测及预后评估提供数据支持，并验证酶标仪在该类检测实验中的准确性和可靠性。

二、实验设计

（一） 实验材料

1、样本：收集30份临床患者血清样本，其中包括10份确诊肝癌患者血清10份肝硬化患者血清以及10份健康人血清，所有样本均经过伦理审查并获得患者知情同意，采集后置于-80℃冰箱保存备用。

2、试剂：AFP ELISA检测试剂盒（包含预包被AFP抗体的微孔板、AFP标准品、生物素标记的检测抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素、底物显色液、终止液、洗涤缓冲液等）、磷酸盐缓冲液（PBS）。

3、仪器：酶标仪（具备450nm波长检测功能）、恒温培养箱、微量移液器及配套吸头、振荡器、离心机。

（二）样本分组与处理

将30份血清样本按照疾病类型分为肝癌组、肝硬化组和健康对照组，每组10个样本。实验前将血清样本从-80℃冰箱取出，置于室温下缓慢解冻，轻轻颠倒混匀后，以3000rpm离心10分钟，取上清液用于后续检测，避免样本中杂质影响检测结果。

三、实验操作步骤

（一） 准备工作

1、从冰箱中取出AFP ELISA 检测试剂盒，平衡至室温（约30分钟），同时将洗涤缓冲液用蒸馏水按1:20比例稀释备用。

2、根据实验需求，将所需的微孔板条放入微孔板框架中，剩余的板条密封后放回试剂盒中，置于4℃保存。

（二） 加样

1、标准品稀释：在1.5ml离心管中，将AFP标准品按照试剂盒说明书进行倍比稀释，制备浓度依次为0ng/mL（空白对照）、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、625ng/mL、3125ng/mL的标准品溶液。

2、加样：分别取50μl不同浓度的标准品溶液加入对应的微孔中，每个浓度设置3个复孔；然后取50μl血清样本加入相应的微孔，同样每个样本设置3个复孔。加样时，移液器吸头应垂直悬空于微孔上方，避免吸头触碰孔壁，防止样本交叉污染。

（三） 温育与洗涤

1、加样完成后，在每孔中加入50μl生物素标记的检测抗体，轻轻振荡微孔板使溶液混合均匀，用封板膜密封微孔板，置于37℃恒温培养箱中温育60分钟，使抗体与抗原充分结合。

2、温育结束后，弃去孔内液体，每孔加入350μl洗涤缓冲液，静置30秒后甩干，重复洗涤5次，以彻底去除未结合的物质，减少背景干扰。洗涤过程中，可使用振荡器辅助，确保洗涤充分。

（四） 显色与终止反应

1、每孔加入100μlHRP标记的链霉亲和素，轻轻振荡混匀，再次用封板膜密封，37℃温育30分钟。

2、温育结束后，重复上述洗涤步骤5次。

3、每孔加入100μl底物显色液，轻轻振荡后，室温避光显色15-20分钟，观察到标准品孔出现明显颜色变化。

4、每孔加入50μl终止液，终止显色反应，此时溶液颜色由蓝色变为黄色。

（五）酶标仪检测

将微孔板放入酶标仪中，设置检测波长为450nm，测定各孔的吸光度（OD值）。在检测前，确保酶标仪预热至稳定状态，并按照仪器操作手册进行校准，以保证检测结果的准确性。

四、实验结果分析

（一）原始数据整理

记录酶标仪检测得到的各标准品孔和样本孔的OD值，剔除明显异常的OD值（如因加样失误、孔内有气泡等导致的数据），计算每个标准品浓度和样本的OD值平均值。

（二）标准曲线绘制

以AFP标准品浓度为横坐标，对应的OD值平均值为纵坐标，使用GraphPad Prism或Excel软件绘制标准曲线。选择合适的曲线拟合方式（如四参数逻辑回归模型），得到标准曲线的回归方程，确保标准曲线的相关系数（R²）大于0.99，以保证曲线的可靠性。

（三）样本浓度计算

将样本的OD值平均值代入标准曲线回归方程，计算出各血清样本中AFP的浓度。同时，计算每组样本（肝癌组、肝硬化组、健康对照组）AFP浓度的平均值、标准差和置信区间。

（四）统计学分析

采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较三组样本AFP浓度的差异，若差异具有统计学意义（P<0.05），进一步使用Tukey多重比较法进行组间两两比较，明确不同组之间的具体差异。

（五） 结果呈现

1、以表格形式展示各标准品浓度、对应的OD值平均值以及样本的AFP浓度计算结果。

2、绘制柱状图直观呈现三组样本AFP浓度的平均值和标准差，清晰展示不同组之间AFP含量的差异。

3、结合统计学分析结果，撰写结果分析报告，阐述实验数据所反映的生物学意义，如肝癌患者血清中AFP浓度显著高于肝硬化患者和健康人，验证AFP作为肿瘤标志物在肝癌诊断中的应用价值。

五、实验结论

本实验成功运用酶标仪结合ELISA技术完成了血清中肿瘤标志物AFP含量的检测。实验结果表明，博清生物科技（南京）有限公司研发生产的酶标仪能够准确测定微孔板中样本的吸光度，通过标准曲线计算得到的样本AFP浓度具有较高的可靠性。不同疾病组患者血清中AFP含量存在显著差异，与临床认知相符，进一步验证了AFP在肿瘤诊断中的重要作用。同时，本实验的操作流程和数据分析方法为其他基于酶标仪的免疫检测实验提供了参考范例，有助于推动相关科研和临床检测工作的开展。在未来的研究中，可进一步扩大样本量，深入探究AFP含量与肿瘤分期、预后等因素的关系，为肿瘤的精准诊疗提供更丰富的依据。